TCT液基細(xì)胞專用玻片分享免疫組化SABC法操作流程

    1、洗載玻片

    將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中，目的是為了是載玻片上的硅膠等除去，同時(shí)使一些肉眼看不見(jiàn)的凹凸不平的表面變平整，便于組織吸附，然后置于清水中清洗，除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4（大約沖一個(gè)小時(shí)左右），再將載玻片浸泡于酒精之中， 然后放到架子上，置于37 oC溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。

    2、包埋組織

    先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。

    3、切片

    將包埋好的組織從模具上取下來(lái)，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過(guò)調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向一致，然后調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5 um，如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40 oC溫水中。

    4、撈組織

    當(dāng)組織載玻片置于40 oC溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開(kāi)，最好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí)，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對(duì)照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候最好方向一致，以便觀察，再將撈出來(lái)的載玻片置于架子上，放入37 oC溫箱中烘干。

    5、脫蠟

    依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據(jù)的是相似相溶的原理。一般在每個(gè)試劑中放10 min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，一般為12-15 min。

    6、抗原修復(fù)

    脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2浸泡10 min，從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3 min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。

    7、血清封閉

    冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5 min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來(lái)，然后放入37 oC溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍（900 ul PBS：100 ul血清封閉液）。

    8、加一抗

    將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4oC冰箱中保存過(guò)夜。

    9、加二抗

    將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37oC溫箱中半小時(shí)。

    10、加SABC

    將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC， 然后置于37oC 溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990ul PBS：10ul SABC）。

    11、加顯色劑

    將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB   B：H2O2   C：磷酸緩沖液

    12、復(fù)染

    將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織3-5min。

    13、脫水

    將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。

    14、封片

    用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。